O diagnóstico laboratorial da sífilis é feito pela pesquisa direta do Treponema pallidum ou pela pesquisa de anticorpos formados durante a infecção, que podem ser de dois tipos: anticorpos não treponêmicos e anticorpos treponêmicos. A pesquisa direta, realizada por microscopia de campo escuro, apesar de altamente específica, tem indicação limitada, podendo ser realizada na fase primária, diretamente do cancro duro do órgão genital ou em outras localizações.

A pesquisa de anticorpos não treponêmicos, inespecífica para o diagnóstico, é feita pela reação de VDRL, que se mostra positiva em provável reação cruzada contra a cardiolipina, componente presente em vários tecidos, sendo indicada como exame de triagem.

A pesquisa de anticorpos treponêmicos, que são específicos contra o Treponema pallidum, é indicada como testes confirmatórios e pode ser realizada pela imunofluorescência indireta (FTA-ABS) e pela hemaglutinação passiva (TPHA).

A sensibilidade da reação de hemaglutinação é similar à do FTA-ABS, com exceção da investigação da fase primária, quando é menos sensível. Assim como no FTA-ABS, se positivos, os anticorpos permanecem por toda a vida como cicatriz sorológica.

O diagnóstico da sífilis congênita baseia-se na presença de anticorpos IgG, sendo o método de escolha a pesquisa do FTA-ABS IgG. Entretanto, um resultado negativo não afasta a possibilidade de infecção, já que a positividade só acontece em cerca de 80% dos casos. A persistência de reações sorológicas positivas, treponêmicas e não treponêmicas, por mais de 6 meses após o nascimento é altamente indicativa de sífilis congênita.