Para se fazer uma reação em cadeia de polimerase (PCR), o gene de interesse precisa ter sido clonado e amplificado em bactérias, pois é necessário conhecer os primers, que serão utilizados na amplificação do DNA in vitro. O seu laboratório utiliza a PCR convencional e a em tempo real para estudar a carga amostral de vírus do tabaco. No entanto, você precisa validar os primers mediante PCR convencional. No seu primeiro experimento, houve contaminação do controle negativo e o aparecimento de bandas inespecíficas. No segundo experimento, você obteve sucesso, ao aumentar a temperatura de melting e controlar o uso de reagentes. Agora a PCR em tempo real poderá ser utilizada, reduzindo o tempo de investigação. Sobre isso, analise as proposições a seguir:
I. A sequência e a concentração adequada do iniciador são primordiais para a especificidade e eficiência da PCR, se ele for mal concebido poderá resultar em pouco ou nenhum produto, por causa de amplificação inespecífica, bem como a formação de dímeros de iniciadores.
II. Na PCR convencional, pode ocorrer contaminação por transferência de reagentes, dispositivos de pipetagem, superfícies de laboratório, material biológico dos próprios pesquisadores, ocasionando resultados falsos.
III. A temperatura de melting (Tm) de uma molécula de DNA, na qual metade das moléculas é de cadeia simples e a outra de cadeia dupla, independe do seu tamanho, porém depende da composição de nucleotídeos, visto que produtos amplificados ricos em guanina e citosina precisam de menor Tm, visto terem apenas duas pontes de hidrogênio e, por isso, é mais fácil haver desnaturação e renaturação.
IV. A PCR em tempo real permite a amplificação, detecção e quantificação do DNA em duas etapas, minimiza o risco de contaminação, contudo confere menor precisão e reprodutibilidade, quando comparada à PCR convencional.
Estão CORRETAS, apenas,